| Production, Purification and Crystallization of a Prokaryotic SLC26 Homolog for Structural Studies
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Author:
Date:
2017-02-05
[Abstract] The SLC26 or SulP proteins constitute a large family of anion transporters that are ubiquitously expressed in pro- and eukaryotes. In human, SLC26 proteins perform important roles in ion homeostasis and malfunctioning of selected members is associated with diseases. This protocol details the production and crystallization of a prokaryotic SLC26 homolog, termed SLC26Dg, from Deinococcus geothermalis. Following these instructions we obtained well-folded and homogenous material of the membrane protein SLC26Dg and the nanobody Nb5776 that enabled us to crystallize the complex and determine its structure (Geertsma et al., 2015). The procedure may be adapted to purify and crystallize other membrane protein complexes.
[摘要] SLC26或SulP蛋白构成在亲和真核生物中普遍表达的大量阴离子转运蛋白。在人类中，SLC26蛋白在离子稳态中起重要作用，选择成员的功能障碍与疾病有关。该方案详细描述了来自地热异常球菌的原核SLC26同源物（称为SLC26Dg）的产生和结晶。按照这些说明，我们获得了膜蛋白SLC26Dg和纳米体Nb5776的良好折叠和均匀的材料，使我们能够使复合物结晶并确定其结构（Geertsma等人，2015）。该方法可以适于纯化和结晶其它膜蛋白复合物。
背景 除了少数例外，膜蛋白的结构表征涉及蛋白质生产水平，洗涤剂溶解状态下的稳定化和结晶的挑战。克服这些障碍所采取的策略取决于有效选择具有优异生物化学性质的SLC26同系物和使用抗体作为结晶伴侣（Geertsma等人，2015）。这里描述的程序并没有大大偏离同事的程序，但在几点上，我们采用其他方法。例如，对于蛋白质生产，我们利用araBAD启动子（Guzman等人，1995），而不是流行的T7启动子（Studier等人，1990）。与T7启动子相反，PAD启动子允许直接调节蛋白质生产水平及其对下游折叠机械的能力的调节，从而减少包涵体的形成（Geertsma， et ...
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| Protein Expression, Purification and Crystallization of the Sxl-Unr-msl2 Ribonucleoprotein Complex
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Author:
Date:
2016-09-05
[Abstract] This protocol describes the expression, purification and crystallization of a ternary protein-protein-RNA complex, consisting of the two RNA recognition motifs (RRMs) of Sex-lethal (Sxl), the first of five cold shock domains of Upstream-of-N-Ras (Unr), and an 18-nucleotide region of msl2 mRNA, called the F fragment (Hennig et al., 2014).The biological role of the complex is the translational repression of msl2 mRNA, preventing the formation of the dosage compensation complex and subsequent 2-fold hypertranscription of X-linked genes in Drosophila females. As orthologous RRM-containing proteins and Unr exist in humans, similar complexes potentially also form during translational repression in vertebrates. The protocol describes the in vitro ...
[摘要] 该协议描述了三元蛋白质 - 蛋白质-RNA复合物的表达，纯化和结晶，其由性致死（Sx1）的两个RNA识别基序（RRM）组成，其是N上游的五个冷休克结构域中的第一个-Ras（Unr）和msl2 mRNA的18个核苷酸的区域，称为F片段（Hennig等人，2014）。复合物的生物学作用是msl2 mRNA的翻译抑制，阻止剂量补偿复合物的形成和随后在果蝇雌性中X连锁基因的2倍超高转录。由于直向同源的含RRM的蛋白质和Unr存在于人类中，类似的复合物也可能在脊椎动物的翻译抑制期间形成。该方案描述了复合物的体外组装及其纯化，随后是用于X射线晶体学结构测定的结晶。协议的一部分已经在别处公开（Hennig等人，2013和2014），但是在此更详细地描述一些部分。
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