| Fluorescence in situ Localization of Gene Expression Using a lacZ Reporter in the Heterocyst-forming Cyanobacterium Anabaena variabilis
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Author:
Date:
2017-01-05
[Abstract] One of the most successful fluorescent proteins, used as a reporter of gene expression in many bacterial, plant and animals, is green fluorescent protein and its modified forms, which also function well in cyanobacteria. However, these fluorescent proteins do not allow rapid and economical quantitation of the reporter gene product, as does the popular reporter gene lacZ, encoding the enzyme β-galactosidase. We provide here a protocol for the in situ localization of β-galactosidase activity in cyanobacterial cells. This allows the same strain to be used for both a simple, quantitative, colorimetric assay with the substrate ortho-nitrophenyl-β-galactoside (ONPG) and for sensitive, fluorescence-based, cell-type localization of gene expression using ...
[摘要] 在许多细菌，植物和动物中用作基因表达的报告基因的最成功的荧光蛋白之一是绿色荧光蛋白及其修饰形式，其在蓝细菌中也起良好作用。然而，与编码β-半乳糖苷酶的流行的报道基因lacZ一样，这些荧光蛋白不允许报道基因产物的快速和经济的定量。我们在这里提供了在蓝细菌细胞中原位β-半乳糖苷酶活性定位的方案。这允许将相同的菌株用于具有底物邻硝基苯基-β-半乳糖苷（ONPG）的简单，定量，比色测定，并且用于灵敏的，基于荧光的细胞型定位使用5-十二烷酰氨基荧光素二-β-D-吡喃半乳糖苷（C12-FDG）的基因表达。
背景 鱼腥藻变种是一种丝状蓝细菌，其区分称为异养细胞的特异性细胞，其特异性用于固氮（Kumar等人，2010; Maldener and Muro Pastor，2010）。由于在96孔中易于定量，酶，比色，β-半乳糖苷酶测定，我们使用大肠埃希氏菌的 lacZ 基因作为蓝细菌基因表达的转录报告基因（Griffith和Wolf，2002）和使用相同的菌株用于使用荧光底物5-十二烷基聚氨基荧光素二-β-D-吡喃半乳糖苷（C12-FDG）的原位定位基因表达的能力（ Thiel等人，1995; ...
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| Preparation of Purified Gram-positive Bacterial Cell Wall and Detection in Placenta and Fetal Tissues
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Author:
Date:
2016-12-05
[Abstract] Cell wall is a complex biopolymer on the surface of all Gram-positive bacteria. During infection, cell wall is recognized by the innate immune receptor Toll-like receptor 2 causing intense inflammation and tissue damage. In animal models, cell wall traffics from the blood stream to many organs in the body, including brain, heart, placenta and fetus. This protocol describes how to prepare purified cell wall from Streptococcus pneumoniae, detect its distribution in animal tissues, and study the tissue response using the placenta and fetal brain as examples.
[摘要] 细胞壁是所有革兰氏阳性菌表面上的复杂生物聚合物。在感染期间，细胞壁被先天免疫受体Toll样受体2识别，引起强烈的炎症和组织损伤。在动物模型中，从血流到体内许多器官（包括脑，心脏，胎盘和胎儿）的细胞壁运输。该协议描述了如何从肺炎链球菌制备纯化的细胞壁，检测其在动物组织中的分布，并且使用胎盘和胎脑作为实例研究组织反应。
关键词： 细胞壁，肽聚糖，细菌炎症，神经增殖，胎儿神经发生，胎盘运输，Toll样受体2配体，肺炎链球菌
/strong>宿主对感染的反应涉及许多细菌组分的识别，包括细胞壁（CW），一种形成所有革兰氏阳性细菌表面的复合大分子。革兰氏阳性细菌的CW由肽聚糖和磷壁酸的共价网络形成。肺炎链球菌是肺炎，败血症和脑膜炎的主要原因，已经成为研究对包括CW在内的革兰氏阳性细菌感染的先天免疫反应的重要模式生物体。 当肺炎链球菌（肺炎球菌）感染时，CW成分在生长期或抗生素诱导的死亡期间从细菌释放，它在血流中循环并穿过细胞屏障，包括胎盘和血脑屏障。 CW组分具有等于或大于完整细菌的炎性活性（Tuomanen等人，1985a和1985b）。 ...
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| Target Gene Inactivation in Cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120
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Author:
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2016-08-05
[Abstract] Anabaena sp. strain PCC 7120 has long served as a model organism for investigating N2-fixation, photosynthesis, and various plant-type metabolic pathways and biofuel production, as well as cellular differentiation (Xu et al., 2008, Halfmann et al., 2014, Golden and Yoon, 2003). Since more than 30,000 sequenced bacterial genomes are currently available (Land et al., 2015), specific gene inactivation and analyses of the corresponding mutant’s phenotype have become powerful tools in elucidating the function of a target gene. Here we describe a protocol to inactivate a target gene in Anabaena sp. PCC 7120 using a single-crossover approach. This approach requires only one-step cloning of an internal fragment of a target gene into an ...
[摘要] 菌株PCC 7120长期充当用于研究N 2 - 固定，光合作用和各种植物类型代谢途径和生物燃料生产以及细胞分化的模式生物体（Xu等人，/em>。，2008，Halfmann等人，2014，Golden and Yoon，2003）。由于目前可获得超过30,000个测序的细菌基因组（Land等人，2015），特异性基因失活和相应突变体表型的分析已成为阐明靶基因功能的有力工具。在这里，我们描述了灭活anabaena sp中的靶基因的方案。 PCC 7120使用单交叉方法。该方法仅需要将靶基因的内部片段一步克隆到整合载体中以产生货物质粒。在货物质粒和鱼腥藻染色体之间的单次交换（同源重组）时，内源靶基因通过产生3'-和5'-缺失的片段而被破坏。该基因失活方案基于整合载体pZR606（Chen等人，2015），其可以广泛应用于其他蓝细菌物种以及其他原核生物中的基因失活。
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