| Detection of Cell Death in Planarians
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Author:
Date:
2018-10-05
[Abstract] Planarians are freshwater flatworms, well known for their ability to regenerate a complete organism from any piece of their body. Furthermore, planarians are constantly growing and degrowing throughout their lives, maintaining a functional and proportioned body. These properties rely on the presence of a population of adult stem cells and on the tight control of their cell renewal, which is based on the balance between the proliferation of new cells and their differentiation, and the death of unnecessary cells. Due to the importance of these two processes in planarian biology, over the years, researchers have optimized molecular techniques to detect both cell proliferation and cell death in planarians. Here, we present the two main protocols currently used for cell death detection and ...
[摘要] 涡虫是淡水扁虫，因其能够从身体的任何部分再生完整的有机体而闻名。 此外，涡虫在其一生中不断生长和去除，保持功能和比例的身体。 这些特性依赖于成体干细胞群的存在以及对细胞更新的严格控制，其基于新细胞增殖与其分化之间的平衡以及不必要细胞的死亡。 由于这两个过程在涡虫生物学中的重要性，多年来，研究人员已经优化了分子技术，以检测涡虫中的细胞增殖和细胞死亡。 在这里，我们提出了目前用于细胞死亡检测和量化的两种主要方案：Caspase-3活性定量和TUNEL分析。
【背景】成体生物体中的细胞更新是基于三个过程的复杂机制：（a）通过细胞死亡消除选定的细胞; （b）通过细胞分裂取代已消除的细胞，通常涉及成体干细胞及其后代; （c）新生细胞的分化及其与先前存在的组织的整合（Pellettieri和Sanchez ...
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| Preparation of Mosquito Salivary Gland Extract and Intradermal Inoculation of Mice
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Author:
Date:
2017-07-20
[Abstract] Mosquito-transmitted pathogens are among the leading causes of severe disease and death in humans. Components within the saliva of mosquito vectors facilitate blood feeding, modulate host responses, and allow efficient transmission of pathogens, such as Dengue, Zika, yellow fever, West Nile, Japanese encephalitis, and chikungunya viruses, as well as Plasmodium parasites, among others. Here, we describe standardized methods to assess the impact of mosquito-derived factors on immune responses and pathogenesis in mouse models of infection. This protocol includes the generation of mosquito salivary gland extracts and intradermal inoculation of mouse ears. Ultimately, the information obtained from using these techniques can help reveal fundamental mechanisms of interaction between ...
[摘要] 蚊子传播的病原体是人类严重疾病和死亡的主要原因之一。蚊子唾液中的组分促进血液供体，调节宿主反应，并允许有效传播病原体，如登革热，紫草，黄热病，西尼罗河，日本脑炎和基孔肯雅病毒，以及疟原虫寄生虫等。在这里，我们描述了评估蚊子衍生因子对小鼠感染模型中免疫反应和发病机制的影响的标准化方法。该方案包括产生蚊子唾液腺提取物和皮内接种小鼠耳朵。最终，使用这些技术获得的信息可以帮助揭示病原体，蚊子和哺乳动物宿主之间的相互作用的基本机制。此外，该协议还可以帮助建立疫苗或治疗剂的临床前检测改进的感染挑战模型，以考虑通过蚊子传播的自然途径。
【背景】在探测血液的同时，蚊子接种有助于喂养的唾液，但如果蚊子曾经感染过感染个体，也可能含有病原体。蚊子唾液在建立感染，促进传播，调节免疫应答和加剧西尼罗河病毒发病过程中发挥重要作用（Schneider等人，2006; Styer等人）。 ，2011），登革热病毒（Cox等人，2012; Conway等人，2014; McCracken等人，2014; Schmid ，2016），基孔肯雅病毒（Agarwal等人，2016），Semliki Forest病毒（Pingen等人，2016） ，裂谷热病毒（Le Coupanec等人，2013）和疟原虫寄生虫（Schneider等人，2011）感染。许多重要问题仍然存在，需要改进动物模型。
＆NBSP;而通过感染的蚊子接种最好地模仿自然传播，接种剂量的高度变异性和有限的昆虫设施的可用性导致这种程序的有限使用。此外，使用感染的蚊子时，不能控制唾液的含量和蚊子组分的存在或不存在。作为替代方案，未感染的雌性蚊子的“斑点喂养”，然后通过针对病原体进行真皮内接种，模拟了唾液在小鼠皮肤中的自然沉积并递送了一定剂量的病原体。 ...
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| Active Cdk5 Immunoprecipitation and Kinase Assay
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Author:
Date:
2017-07-05
[Abstract] Cdk5 activity is regulated by the amounts of two activator proteins, p35 and p39 (Tsai et al., 1994; Zheng et al., 1998; Humbert et al., 2000). The p35-Cdk5 and p39-Cdk5 complexes have differing sensitivity to salt and detergent concentrations (Hisanaga and Saito, 2003; Sato et al., 2007; Yamada et al., 2007; Asada et al., 2008). Cdk5 activation can be directly measured by immunoprecipitation of Cdk5 with its bound activator, followed by a Cdk5 kinase assay. In this protocol, buffers for cell lysis and immunoprecipitation are intended to preserve both p35- and p39-Cdk5 complexes to assess total Cdk5 activity. Cells are lysed and protein concentration is determined in the post-nuclear supernatant. Cdk5 is immunoprecipitated from equal ...
[摘要] Cdk5活性受两种激活蛋白p35和p39（Tsai et al。，1994; Zheng et al。，1998; Humbert等人）的量的调节，2000）。 p35-Cdk5和p39-Cdk5复合物对盐和洗涤剂浓度的敏感性不同（Hisanaga和Saito，2003; Sato et al。，2007; Yamada等人， 2007; Asada 等人，2008）。 Cdk5激活可以通过Cdk5与其结合的激活剂的免疫沉淀直接测量，随后进行Cdk5激酶测定。在该方案中，用于细胞裂解和免疫沉淀的缓冲液旨在保持p35-和p39-Cdk5复合物以评估总Cdk5活性。裂解细胞，并在核后上清液中测定蛋白浓度。 Cdk5在实验组之间从等量的总蛋白免疫沉淀。然后进行洗涤以除去外来蛋白质并平衡激酶缓冲液中的Cdk5-活化剂复合物。然后将Cdk5与组蛋白H1孵育，组蛋白H1是Cdk5和[γ- 32 P] ATP在体外成功建立的靶标。反应通过SDS-PAGE解析并转移到膜上，用于可视化H1磷酸化和免疫沉淀的Cdk5水平的免疫印迹。我们已经使用该测定来建立p39作为少突神经胶质谱系中Cdk5的主要活化剂。然而，该测定法适用于对裂解条件进行适当调整的其它细胞谱系或组织。
【背景】虽然Cdk5通常与神经元功能相关，但最近的工作已经证明Cdk5也可以调节少突胶质细胞祖细胞（OPC）的发育（Tang等人，1998; ...
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