| In vitro Osteoclastogenesis Assays Using Primary Mouse Bone Marrow Cells
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Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] Osteoclasts are a group of bone-absorbing cells to degenerate bone matrix and play pivotal roles in bone growth and homeostasis. The unbalanced induction of osteoclast differentiation (osteoclastogenesis) in pathological conditions, such as osteoporosis, arthritis and skeleton metastasis of cancer, causes great pain, bone fracture, hypercalcemia or even death to patients. In vitro osteoclastogenesis analysis is useful to better understand osteoclast formation in physiological and pathological conditions. Here we summarized an easy-to-follow osteoclastogenesis protocol, which is suitable to evaluate the effect of different factors (cytokines, small molecular chemicals and conditioned medium from cell culture) on osteoclast differentiation using primary murine bone marrow cells.
[摘要] 破骨细胞是一组骨吸收细胞，用于退化骨基质并在骨生长和体内平衡中发挥关键作用。 在诸如骨质疏松症，关节炎和癌症骨骼转移等病理状态下破骨细胞分化（破骨细胞生成）的不平衡诱导会导致严重疼痛，骨折，高钙血症或甚至导致患者死亡。 体外破骨细胞生成分析对于更好地理解生理和病理条件下的破骨细胞形成是有用的。 在这里，我们总结了一种易于遵循的破骨细胞生成方案，其适用于评估不同因素（细胞因子，小分子化学物质和来自细胞培养物的条件培养基）对使用原代鼠骨髓细胞的破骨细胞分化的影响。
【背景】骨骼在生命周期内通过连续且良好控制的吸光度和骨量形成来维持。在骨腔中，这两种活性中的每一种都是通过特定的细胞类型进行的：骨形成性成骨细胞和骨降解性破骨细胞。成骨细胞和破骨细胞分别来自骨驻留间充质细胞和造血谱系祖细胞。造血系统骨髓祖细胞分化为成熟破骨细胞主要受核因子-κB配体受体激活因子（RANKL，由TNFSF11编码）和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF，由< ）来自成骨细胞及其祖细胞（suda et al。 ，1999）。与其他细胞不同，破骨细胞通过融合一定数量的祖细胞而分化（boyle等人，2003）。因此，成熟破骨细胞的关键组织学特征是它们的多个核。成熟后，破骨细胞能够通过产生酸化的微环境来溶解主要由磷酸钙组成的骨质以及蛋白酶以降解细胞外基质（boyle等人，2003），从而能够骨吸收。溶解的骨基质释放成骨细胞使用的隔离生长因子以扩大其人群（kassem和bianco，2015）。成骨细胞和破骨细胞之间的这种相互作用确保了协调的骨形成和 - 退化活性，其在包括骨质疏松症，关节炎和癌症骨转移的过多疾病中失调（rodan和martin，2000; raisz，2005; gupta和massague ，2006）。根据之前的文献（lu等人，2009; wang等人，2014; zhuang等人，2017），在此我们描述使用原代鼠骨髓细胞进行体外破骨细胞发生试验的逐步方案，其允许研究广泛范围的因子/条件（例如细胞因子和条件培养基）对破骨细胞的影响分化。 ）来自成骨细胞及其祖细胞（suda="" et="" al。="" ，1999）。与其他细胞不同，破骨细胞通过融合一定数量的祖细胞而分化（boyle等人，2003）。因此，成熟破骨细胞的关键组织学特征是它们的多个核。成熟后，破骨细胞能够通过产生酸化的微环境来溶解主要由磷酸钙组成的骨质以及蛋白酶以降解细胞外基质（boyle等人，2003），从而能够骨吸收。溶解的骨基质释放成骨细胞使用的隔离生长因子以扩大其人群（kassem和bianco，2015）。成骨细胞和破骨细胞之间的这种相互作用确保了协调的骨形成和="" -="" 退化活性，其在包括骨质疏松症，关节炎和癌症骨转移的过多疾病中失调（rodan和martin，2000;="" raisz，2005;="" gupta和massague="" ，2006）。根据之前的文献（lu等人，2009;="" wang等人，2014;=""> ...
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| Coupling Exonuclease Digestion with Selective Chemical Labeling for Base-resolution Mapping of 5-Hydroxymethylcytosine in Genomic DNA
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Author:
Date:
2018-03-05
[Abstract] This protocol is designed to obtain base-resolution information on the level of 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) in CpGs without the need for bisulfite modification. It relies on (i) the capture of hydroxymethylated sequences by a procedure known as ‘selective chemical labeling’ (see Szulwach et al., 2012) and (ii) the digestion of the captured DNA by exonucleases. After Illumina sequencing of the digested DNA fragments, an ad hoc bioinformatic pipeline extracts the information for further downstream analysis.
[摘要] 该协议旨在获得CpGs中5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）水平的碱基分辨率信息，而无需亚硫酸氢盐修饰。 它依赖于（i）通过称为“选择性化学标记”（参见Szulwach等人，2012）的方法捕获羟甲基化序列和（ii）通过外切核酸酶消化捕获的DNA。 在消化的DNA片段的Illumina测序之后，特设的生物信息学管道提取信息用于进一步的下游分析。
【背景】基因组DNA中胞嘧啶的甲基化可以被蛋白质读取，并且主要被翻译成基因沉默。基因组中的大多数CpG二核苷酸是甲基化的，包括位于基因调控区如增强子的那些。然而，当需要时，这些CpG可以通过Ten Eleven Translocation（TET）酶将甲基氧化并且通过碱基切除修复系统用未甲基化的胞嘧啶置换来去甲基化。 5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）是5-甲基胞嘧啶的第一个氧化衍生物，并且在基因组中绘制该修饰的碱基提供了关于正在进行活性去甲基化的区域的信息。尽管选择性化学标记（SCL）可以非常特异地检测5hmC，但该技术的分辨率受DNA片段大小的限制，特别是当捕获的DNA中存在多个CpG时。为了提高分辨率，我们引入了使用外切核酸酶的消化步骤，所述核酸外切酶将DNA分子修剪成靠近羟甲基化的胞嘧啶（Sérandour et。，2016）。然后对测序读数进行适当的生物信息学处理，然后将羟甲基化评分赋予捕获的CpG。
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| Fluorescent Measurement of Synaptic Activity Using FM Dyes in Dissociated Hippocampal Cultured Neurons
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Author:
Date:
2018-01-20
[Abstract] Release and recycling of synaptic vesicles are essential for neurotransmission and synaptic plasticity. To gain mechanistic understanding of these processes, direct measurements of vesicle release and retrieval is indispensable. Styryl dyes like FM1-43 and FM4-64 have been widely used for this purpose and their loading and unloading are reliable measurements for synaptic vesicle release and retrieval in cultured neurons. This protocol describes in detail the procedure of using styryl dyes to label and measure synaptic vesicle uptake and release in cultured rat hippocampal neurons. We also include a brief description of hippocampal culture. In the end, we briefly discuss the commonality and difference among FM dye, pH-sensitive fluorescent proteins and quantum dots in terms of measuring ...
[摘要] 突触小泡的释放和再循环对于神经传递和突触可塑性是至关重要的。 为了获得对这些过程的机械理解，直接测量囊泡释放和回收是必不可少的。 苯乙烯基染料如FM1-43和FM4-64已被广泛用于此目的，其装载和卸载是可靠的测量突触小泡释放和恢复培养的神经元。 该协议详细描述了使用苯乙烯基染料来标记和测量培养的大鼠海马神经元中的突触小泡摄取和释放的程序。 我们还包括对海马文化的简要描述。 最后，我们简要讨论FM染料，pH敏感荧光蛋白和量子点在测量突触小泡行为方面的共性和差异。
【背景】突触小泡是神经传递不可或缺的，因为它们是化学突触中负责神经递质释放的唯一细胞器。它们的数量，释放概率，融合动力学和再循环路线定义了突触传递和神经元交流。已经开发了多种用于探测突触囊泡的工具，包括突触后神经元的电生理学记录，膜运输的电容测量，可氧化的发射体的电流分析，固定突触的电子显微镜成像以及活神经元中的囊泡标记的荧光成像。在所有现有的方法中，最后一个是不仅产生关于个体突触的空间和时间信息，而且提供高吞吐量（即，来自不同神经元的单个突触的更多数据点）的唯一方法。已经开发了基于不同定向和报告机制的各种荧光探针。二十多年前发明的苯乙烯基染料（即FM染料，包括FM1-43，FM4-64，FM5-95）仍然是一种可靠而方便的工具。由于其对脂质膜的中等亲和力及其对脂质敏感的排放，可以容易地装载到再循环的突触囊泡中并且当这些囊泡被胞吐出时释放。使用更敏感的光电探测器如EMCCD，FM染料可以报告单个囊泡释放事件。在这里，我们提供了一个相对完整的基于FM的啮齿动物海马神经元原代培养的突触小泡释放成像的描述。此外，我们还讨论了FM染料和其他荧光泡标签的共性和区别。 ...
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