| Flow Cytometry Measurement of Glucocerebrosidase Activity in Human Monocytes
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Author:
Date:
2020-04-05
[Abstract] Glucocerebrosidase (GCase) is an important enzyme for the metabolism of glycolipids. GCase enzyme deficiency is implicated in human disease and the efficient measurement of GCase activity is important for evaluating the efficacy of therapeutics targeting this enzyme. Existing approaches to measure GCase activity include whole blood mass spectrometry-based assays, where an internal standard is used to measure the accumulation of ceramide following metabolism of the synthetic substrate C12-glucocerebroside, and the utilisation of fluorescent probes that bind active GCase and/or release fluorescent metabolites upon cleavage by GCase. Here, we describe the application of a fluorescence-activated cell sorter-based assay to efficiently quantitate GCase enzyme activity in the monocyte population ...
[摘要]
[摘要 ] 葡萄糖脑苷脂酶（GCase ）是糖脂代谢的重要酶。GCase 酶缺乏症与人类疾病有关，GCase 活性的有效测量对于评估靶向该酶的治疗剂的功效至关重要。现有的测量GCase 活性的方法包括基于全血质谱的分析，其中使用内标测量合成底物C12-葡萄糖脑苷代谢后神经酰胺的积累，以及利用结合活性GCase 和// 的荧光探针的利用。或通过GCase 裂解后释放荧光代谢物 。在这里，我们描述了基于荧光激活细胞分选术的测定方法的应用，以有效地定量人类外周血单核细胞单核细胞群中的GCase 酶活性。细胞渗透性的GCase 衬底5-（Pentafluorobenzoylamino ）荧光素二-β-D- 吡喃葡萄糖苷（PFB- FDGlu ）提供了一个用于测量的GCase 活性，由此酶裂解产生的绿色荧光PFB-F染料，在FL-检测流式细胞仪的1个通道。使用溶酶体GCase 活性抑制剂，conduritol B-环氧，以确保特异性。该协议为测量活的单个细胞中的GCase 活性提供了一种有利的方法。
[背景 ] 葡萄糖脑苷脂酶（GCase ），由 GBA1基因是一种溶酶体水解酶，可将葡糖神经酰胺转化为葡萄糖和神经酰胺。GBA1 ...
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| Polyethylene Glycol-mediated Transformation of Drechmeria coniospora
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Author:
Date:
2017-03-05
[Abstract] Drechmeria coniospora is a nematophagous fungus and potential biocontrol agent. It belongs to the Ascomycota. It is related to Hirsutella minnesotensis, another nematophagous fungus but, phylogenetically, it is currently closest to the truffle parasite Tolypocladium ophioglossoides. Together with its natural host, Caenorhabditis elegans, it is used to study host-pathogen interactions. Here, we report a polyethylene glycol-mediated transformation method (Turgeon et al., 2010; Ochman et al., 1988) for this fungus. The protocol can be used to generate both knock-in or knock-out strains (Lebrigand et al., 2016).
[摘要] Drechmeria coniospora 是一种无害真菌和潜在的生物防治剂。它属于子囊菌纲。它与另外一种没食子菌真菌Hirsutella minnesotensis有关，但在系统发育中，它目前最接近松露寄生虫Tolypocladium ophioglossoides 。与其天然宿主，秀丽隐杆线虫一起，它用于研究宿主 - 病原体相互作用。在这里，我们报告了这种真菌的聚乙二醇介导的转化方法（Turgeon等人，2010; Ochman等人，1988）。该方案可用于产生敲入或敲除菌株（Lebrigand等人，2016）。
背景 D。 coniospora 已被开发为用于研究先天免疫的模型病原体。 elegans （Lebrigand等人，2016和其中的参考文献）。 D。 coniospora 在标准生长培养基上缓慢增长，使得体外研究困难，难以开发转化方法。我们在这里报告一种允许快速生产大量的D的文化方法。 coniospora ，开辟了其遗传修饰的道路。聚乙二醇介导的转化可能是广泛应用于修饰真菌的最简单的方法。我们发现它可以与一起使用。 coniospora ，因此提供了故意修改其基因组的第一种方法。
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| TGFβ Release Co-culture Assay
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Author:
Date:
2014-12-05
[Abstract] TGFβ is a potent cytokine modulating various processes including proliferation, differentiation, ECM synthesis and apoptosis (Siegel and Massague, 2003). Thus in many tissues availability of TGFβ is tightly regulated. TGFβ is secreted as an inactive complex where it is encapsulated by the latency associated protein (LAP), a ligand trap protein, which inhibits TGFβ binding to its receptor and retains TGFβ in the extracellular matrix (ten Dijke and Arthur, 2007). TGFβ can be released from the matrix and converted into its biological active form by huge number of processes including heat, high and low pH, release of reactive oxygen species (ROS) or various proteases (e.g. plasmin, elastase, matrix metalloproteinase-2 and -9) (Barcellos-Hoff and Dix, 1996; Lyons et al., ...
[摘要] TGFβ是调节各种过程包括增殖，分化，ECM合成和凋亡的有效细胞因子（Siegel和Massague，2003）。因此，在许多组织中，TGFβ的可用性受到严格调控。 TGFβ作为无活性复合物分泌，其中其被潜伏相关蛋白（LAP）封闭，LAP是一种配体捕获蛋白，其抑制TGFβ与其受体结合并在细胞外基质中保留TGFβ（十Dijke和Arthur，2007）。 TGFβ可以从基质中释放并通过大量的过程包括热，高和低pH，活性氧（ROS）或各种蛋白酶（例如，纤溶酶，弹性蛋白酶）的释放而转化为其生物活性形式，基质金属蛋白酶-2和-9）（Barcellos-Hoff和Dix，1996; Lyons等人，1988; Taipale等人，1994; Yu和Stamenkovic， 2000）。然而，在生理条件下，αv-类整联蛋白与LAP蛋白中的RGD三肽基序的相互作用代表了体内TGFβ释放的关键因素。具有整联蛋白结合缺陷型LAP蛋白（RGD基序突变为RGE）的小鼠重现了TGFβ1缺失的所有主要表型，进一步强调了整合素介导的TGFβ释放对体内发育和体内平衡的相关性小鼠，包括多器官炎症和血管发生中的缺陷（Shull等人，1992; Yang等人，2007）。这种引人注目的表型与TGFβ缺陷小鼠重叠，缺少αv-类整联蛋白的小鼠的表型（Aluwihare等人，2009; ...
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