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HEPES (1 M)

HEPES(1M)

Company: Thermo Fisher Scientific
Catalog#: 15630056
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Coupling Exonuclease Digestion with Selective Chemical Labeling for Base-resolution Mapping of 5-Hydroxymethylcytosine in Genomic DNA
Author:
Date:
2018-03-05
[Abstract]  This protocol is designed to obtain base-resolution information on the level of 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) in CpGs without the need for bisulfite modification. It relies on (i) the capture of hydroxymethylated sequences by a procedure known as ‘selective chemical labeling’ (see Szulwach et al., 2012) and (ii) the digestion of the captured DNA by exonucleases. After Illumina sequencing of the digested DNA fragments, an ad hoc bioinformatic pipeline extracts the information for further downstream analysis. [摘要]  该协议旨在获得CpGs中5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)水平的碱基分辨率信息,而无需亚硫酸氢盐修饰。 它依赖于(i)通过称为“选择性化学标记”(参见Szulwach等人,2012)的方法捕获羟甲基化序列和(ii)通过外切核酸酶消化捕获的DNA。 在消化的DNA片段的Illumina测序之后,特设的生物信息学管道提取信息用于进一步的下游分析。

【背景】基因组DNA中胞嘧啶的甲基化可以被蛋白质读取,并且主要被翻译成基因沉默。基因组中的大多数CpG二核苷酸是甲基化的,包括位于基因调控区如增强子的那些。然而,当需要时,这些CpG可以通过Ten Eleven Translocation(TET)酶将甲基氧化并且通过碱基切除修复系统用未甲基化的胞嘧啶置换来去甲基化。 5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)是5-甲基胞嘧啶的第一个氧化衍生物,并且在基因组中绘制该修饰的碱基提供了关于正在进行活性去甲基化的区域的信息。尽管选择性化学标记(SCL)可以非常特异地检测5hmC,但该技术的分辨率受DNA片段大小的限制,特别是当捕获的DNA中存在多个CpG时。为了提高分辨率,我们引入了使用外切核酸酶的消化步骤,所述核酸外切酶将DNA分子修剪成靠近羟甲基化的胞嘧啶(Sérandour et。,2016)。然后对测序读数进行适当的生物信息学处理,然后将羟甲基化评分赋予捕获的CpG。

Differentiation of Myeloid-derived Suppressor Cells from Murine Bone Marrow and Their Co-culture with Splenic Dendritic Cells
Author:
Date:
2017-09-20
[Abstract]  Myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) possess the ability to suppress the immune response, and to amplify the regulatory properties of other immune cells, i.e., dendritic cells. Here we describe a protocol in which MDSCs were differentiated from murine bone marrow cells, and CD11c+ dendritic cells were purified from murine spleens. MDSCs and CD11c dendritic cells can be co-cultured and the immunoregulatory phenotype of the MDSCs-conditioned dendritic cells could be assessed by means of a specific functional in vivo experiment, i.e., a skin test as a measure of the delayed-type hypersensitivity reaction toward a poorly immunogenic antigen. [摘要]  骨髓来源的抑制细胞(MDSCs)具有抑制免疫应答的能力,并扩增其他免疫细胞即树突状细胞的调节特性。 在这里,我们描述了MDSC与鼠骨髓细胞分化的方案,并且从鼠脾中纯化CD11c +树突状细胞。 可以共培养MDSC和CD11c树突状细胞,并且可以通过特定的功能体内实验来评估MDSCs条件树突细胞的免疫调节表型,即皮肤试验作为延迟型超敏反应的量度 抗免疫原性较差的抗原。
【背景】骨髓来源的抑制细胞(MDSCs)是由早期分化阶段的巨噬细胞,粒细胞,树突状细胞和骨髓细胞的前体组成的骨髓细胞组(Youn等人,2008),其在肿瘤的淋巴组织中大量积累感染性小鼠以及感染性疾病,败血症和创伤的小鼠。这些细胞的主要特征是它们以Ag特异性和/或非特异性方式抑制T细胞应答的能力。这些细胞现在被认为是负责肿瘤相关免疫缺陷的主要细胞类型之一;涉及MDSC介导的免疫抑制的主要因素包括Arg1的高表达(Marvel和Gabrilovich,2015)。精氨酸酶1(Arg1)和吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)分别是催化L-精氨酸(L-Arg)和L-色氨酸(L-Trp)降解的免疫调节酶,导致局部氨基酸剥夺。此外,与Arg1不同,IDO1在树突细胞(DC)中也具有非酶信号传导活性(Mondanelli等,2017)。除了其固有的免疫抑制活性外,MDSC还可能扩增其他免疫细胞的调节特性,特别是在肿瘤微环境中。虽然建立了MDSC-巨噬细胞相互作用的一些机制(Ugel等,2015),MDSCs和DCs之间的串扰仍然不清楚(Ostrand-Rosenberg等,2012);为弥补这一差距,我们已经制定了该方案,并且我们证明了Arg1 ...

Efficient Generation of Multi-gene Knockout Cell Lines and Patient-derived Xenografts Using Multi-colored Lenti-CRISPR-Cas9
Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract]  CRISPR-Cas9 based knockout strategies are increasingly used to analyze gene function. However, redundancies and overlapping functions in biological signaling pathways can call for generating multi-gene knockout cells, which remains a relatively laborious process. Here we detail the application of multi-color LentiCRISPR vectors to simultaneously generate single and multiple knockouts in human cells. We provide a complete protocol, including guide RNA design, LentiCRISPR cloning, viral production and transduction, as well as strategies for sorting and screening knockout cells. The validity of the process is demonstrated by the simultaneous deletion of up to four programmed cell death mediators in leukemic cell lines and patient-derived acute lymphoblastic leukemia xenografts, in which ... [摘要]  基于CRISPR-Cas9的敲除策略越来越多地用于分析基因功能。然而,生物信号通路中的冗余和重叠功能可能需要产生多基因敲除细胞,这仍然是一个相对费力的过程。在这里,我们详细介绍了多色LentiCRISPR载体在人体细胞中同时产生单次和多次敲除的应用。我们提供了一个完整的方案,包括指导RNA设计,LentiCRISPR克隆,病毒生产和转导,以及排序和筛选敲除细胞的策略。该过程的有效性通过同时删除白血病细胞系中多达四个程序性细胞死亡介质和来自患者来源的急性淋巴细胞白血病异种移植物,其中单细胞克隆是不可行的。该协议允许任何具有基本细胞生物学设备的实验室,生物安全2级设备和荧光激活细胞分选功能,可在一个月内有效产生单基因和多基因敲除细胞系或原代细胞。

从对细菌基因组中被称为聚簇定期交织的短回文重复(CRISPR)的遗传元件的好奇的初步观察开始(Ishino等人,1987; Mojica等人,2000 )和随后在哺乳动物细胞中的基因编辑(Cong等人,2013; Mali等人,2013),CRISPR-Cas9已经成为廉价和有效的基因编辑。随着从烟草植物细胞到斑马鱼和原代人类细胞(Hsu等人,2014)的细胞系统的成功应用,CRISPR-Cas9可以通过短的20个核苷酸RNA序列的设计来引导在大基因组内的靶向DNA双链断裂(DSB)(Park等人,2016)。 ...

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