| Preparation of Cell-free Synthesized Proteins Selectively Double Labeled for Single-molecule FRET Studies
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Author:
Date:
2018-06-20
[Abstract] Single-molecule FRET (smFRET) is a powerful tool to investigate molecular structures and conformational changes of biological molecules. The technique requires protein samples that are site-specifically equipped with a pair of donor and acceptor fluorophores. Here, we present a detailed protocol for preparing double-labeled proteins for smFRET studies. The protocol describes two cell-free approaches to achieve a selective label scheme that allows the highest possible accuracy in inter‐dye distance determination.
[摘要] 单分子FRET（smFRET）是研究生物分子的分子结构和构象变化的有力工具。 该技术需要蛋白质样品，该样品是特定位点配有一对供体和受体荧光团的。 在这里，我们提供了一个制备smFRET研究的双标记蛋白的详细方案。 该协议描述了两种无细胞方法来实现选择性标记方案，其允许在染料间距离确定中具有最高可能的准确性。
【背景】单分子FRET（smFRET）是结构生物学中最重要的工具之一，特别是用于分析蛋白质的结构和功能构象变化（Michalet等人，2006; Roy等人。，2008; Sustarsic和Kapanidis，2015）。然而，smFRET的广泛应用在许多情况下受限于合适的蛋白质样品的精细生产。这些蛋白质需要配备两个荧光团，位点特异性连接在蛋白质结构内的不同位置。
经典的基于细胞的蛋白质生产需要一系列耗时的步骤，可以通过使用无细胞蛋白质合成（CFPS）系统来克服，允许更快且直接地生产和选择适当的双标记蛋白质。此外，CFPS的另一个优点是由于几类蛋白质如蛋白酶或膜蛋白对活细胞或其他原因有毒，难以在细胞中表达，可以在CFPS系统中成功合成。最后，CFPS是专注于光谱技术如smFRET的实验室的理想工具，因为细胞培养不是必需的，并且不必考虑重组生物的安全规定。
尽管smFRET所需的样本量本质上很低，但迄今为止，在smFRET研究中，CFPS尚未被标准地用于生产样本。这主要是由于与基于细胞的系统相比蛋白质产量低得多，并且缺乏适当的无细胞方法，其允许适当量的双标记蛋白质的方便合成。然而，正如我们的小组所表明的那样，得益于更高效的正交标记方案（Sadoine ...
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| Registration and Alignment Between in vivo Functional and Cytoarchitectonic Maps of Mouse Visual Cortex
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Author:
Date:
2018-02-20
[Abstract] This protocol describes a method for registration of in vivo cortical retinotopic map with cytochrome c oxidase (CO) labeled architectonic maps of the same mouse brain through the alignment of vascular fiducials. By recording surface blood vessel pattern and sequential alignment at each step, this method overcomes the challenge imposed by tissue distortion during perfusion, mounting, sectioning and histology procedures. This method can also be generalized to register and align other types of in vivo functional maps like ocular dominance map and spatial/temporal frequency tuning map with various anatomical maps of mouse cortex.
[摘要] 该协议描述了通过血管基准点的对齐使用细胞色素c氧化酶（CO）标记的相同小鼠脑的构建图来注册体内皮质视网膜地图的方法。 通过记录每个步骤的表面血管图案和顺序对准，该方法克服了在灌注，贴壁，切片和组织学程序期间由组织变形所施加的挑战。 这种方法也可以推广到注册和对齐其他类型的体内功能地图，如眼优势地图和空间/时间频率调整地图与小鼠皮层的各种解剖图。
【背景】通过体内视网膜映射（Marshel等人，2011; Garrett等人，），可以将小鼠视觉皮层分隔成功能上不同的视觉区域。 （Olavarria and Montero，1989; Wang and Burkhalter，2007），或者通过建筑结构辅助的神经元追踪技术，这些不同的视觉区域具有不同的响应特性和皮质皮质连接（Andermann等人，2011; Marshel等人，2011; Roth等人， >，2012; Wang等人，2011和2012）。这些结果表明，鼠标视觉区域形成处理不同类型的视觉信息的分离的视觉流（Murakami等人，2017; Smith等人，2017）。在视觉区域地图的背景下研究鼠标视觉系统对于理解视觉皮层的组织是至关重要的。然而，虽然功能图和结构图大致相似，但是这两幅图显示的并不完美（Zhuang et ...
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| Culture and Nucleofection of Postnatal Day 7 Cortical and Cerebellar Mouse Astroglial Cells
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] Lineage reprogramming of astroglial cells isolated from different brain regions leads to the generation of different neuronal subtypes. This protocol describes the isolation and culture of neocortical and cerebellar astrocytes from postnatal mice. We also present a comprehensive description of the main steps towards successful gene delivery in these cells using nucleofection. Neocortex and cerebellum astrocyte cultures obtained with these methods are suitable for the study of molecular and cellular mechanisms involved in direct cell lineage reprogramming into induced neurons (iNs).
[摘要] 从不同脑区分离的星形胶质细胞的谱系重编程导致产生不同的神经元亚型。 该协议描述了来自出生后小鼠的新皮质和小脑星形胶质细胞的分离和培养。 因此，我们全面描述了使用nucleofection在这些细胞中成功进行基因传递的主要步骤。 在涉及直接细胞谱系重编程为诱导神经元（iNs）的分子和细胞机制研究中获得的新皮质和小脑星形胶质细胞培养物。
【背景】文献中广泛描述了星形胶质细胞培养（Saura，2007，Schildge等人，2013）。几种方案，主要是细胞分离的步骤数不同，产生足够纯度的星形胶质细胞培养物（高达98％）。然而，大多数方案被描述为“关注从新皮层分离星形胶质细胞并使用化学解离”（Schildge等人，2013）。在这里，我们提供了一种替代方法来产生高浓缩的星形胶质细胞单层，而不需要化学组织解离，这使得方案比以前的方法更快。此外，我们强调新皮层和小脑星形胶质细胞的分离和培养，突出了这两个细胞群体之间的一些重要差异。最后，我们描述了使用核转染在星形胶质细胞中基因递送的替代的，成本有效的方法（Chouchane等人，2017）。该技术由使用特定电压和试剂的细胞电穿孔后直接递送DNA分子组成。与逆转录病毒介导的转染相比（Heines等，2002; Berninger等） / ，2007，Heinrich等人，2012; ...
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