| Methylation-sensitive Amplified Polymorphism as a Tool to Analyze Wild Potato Hybrids
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Author:
Date:
2020-07-05
[Abstract] Methylation-Sensitive Amplification Polymorphism (MSAP) is a versatile marker for analyzing DNA methylation patterns in non-model species. The implementation of this technique does not require a reference genome and makes it possible to determine the methylation status of hundreds of anonymous loci distributed throughout the genome. In addition, the inheritance of specific methylation patterns can be studied. Here, we present a protocol for analyzing DNA methylation patterns through MSAP markers in potato interspecific hybrids and their parental genotypes.
[摘要] [摘要]甲基化敏感扩增多态性(MSAP)是一种用于分析非模型物种DNA甲基化模式的多功能标记。这种技术的实施不需要参考基因组，并且可以确定分布在整个基因组中的数百个匿名位点的甲基化状态。此外，特定甲基化模式的遗传可以被研究。在这里，我们提出了通过MSAP标记分析马铃薯种间杂交种及其亲本基因型的DNA甲基化模式的协议。
[背景]核苷酸序列并不是基因组信息的唯一形式，DNA甲基化、组蛋白、修改DNA上的组蛋白和核苷酸残基的酶，甚至RNA，都会影响基因的活动，并为细胞提供另一层指令。DNA甲基化、组蛋白、修改组蛋白的酶和DNA上的核苷酸残基，甚至RNA，都会影响基因活动，并为细胞提供另一层指令。表观遗传学变化，也称为表观遗传，可以遗传，并具有重要的表型后果。在植物中，甲基化反应将胞嘧啶残基修饰成5-甲基胞嘧啶。这种表观遗传机制对于维持基因组的完整性是至关重要的，并有助于调节基因在发育过程中的表达以及对生物和非生物胁迫的反应。此外，DNA甲基化的变化是由杂交和多倍体化等基因组冲击引发的，这是植物进化过程中的两个重要现象（Cara et al., 2019)。
有各种不同的方法来研究DNA甲基化的变化。可以使用高效液相色谱法(HPLC)评估全局性的胞嘧啶甲基化，这种分析方法可以量化胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶，并计算基因组中甲基化残基的百分比。对于研究基因组上特定位置的DNA甲基化，可以提到两种选择。一种是使用对限制性位点胞嘧啶甲基化具有不同敏感性的异构体。例如，甲基化敏感扩增多态性(MSAP)标记表征来自随机基因组DNA的匿名5′-CCGG序列处的甲基化模式。这是对原始AFLP协议的改编(Voset ...
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| Rolling Circle Amplification to Screen Yam Germplasm for Badnavirus Infections and to Amplify and Characterise Novel Badnavirus Genomes
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Author:
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2018-01-05
[Abstract] Since the first discovery of badnaviruses (family Caulimoviridae, genus Badnavirus) in yam (Dioscorea spp.) germplasm in the 1970s (Harrison and Roberts, 1973), several hundred partial badnavirus reverse transcriptase (RT)-ribonuclease H (RNaseH) sequences have been characterised (Kenyon et al., 2008; Bousalem et al., 2009), but only a few complete Dioscorea bacilliform virus (DBV) genome sequences have been reported (Phillips et al., 1999; Seal and Muller, 2007; Bömer et al., 2016 and 2017; Sukal et al., 2017; Umber et al., 2017). We have optimised a workflow involving total nucleic acid extractions and rolling circle amplification (RCA) combined with restriction enzyme analysis for the detection ...
[摘要] 自二十世纪七十年代山药（Dioscorea spp。）种质中首次发现坏病毒属（家庭花椰菜科，属于病毒属）之后（Harrison和Roberts， 1973），已经表征了数百个部分坏死病毒逆转录酶（RT） - 核糖核酸酶H（RNaseH）序列（Kenyon等人，2008; Bousalem等人，2009年），但仅有少数几种完整的Dioscorea杆状病毒（DBV）基因组序列已被报道（Phillips等，1999; Seal和Muller，2007;Bömer等， 2016和2017; Sukal等人，2017; Umber等人，2017）。我们优化了总核酸提取和滚环扩增（RCA）结合限制性酶分析的工作流程，以检测和扩增山药种质中存在的DBV。我们已经使用这种方法成功地揭示了三种新型附加体阴性坏死病毒（Bömer等人，2016年）。我们提出这是变性梯度凝胶电泳的补充方法，其能够快速指示坏死病毒多样性以及在宿主基因组中鉴定潜在整合的坏死病毒序列（Turaki等人，2017年） ）。在这里，我们描述了一步一步的方案来筛选山药种质的坏死病毒感染使用RCA作为一个有效的研究工具，在扩增和表征的新型坏死病毒基因组。
【背景】RCA是经常用于扩增环状DNA病毒基因组的序列无关的策略（Rector等人，2004）。 Phi29聚合酶介导的RCA技术用于（i）检测新型病毒; ...
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| Generation of Mutant Pigs by Direct Pronuclear Microinjection of CRISPR/Cas9 Plasmid Vectors
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Author:
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2017-06-05
[Abstract] A set of Cas9 and single guide CRISPR RNA expression vectors was constructed. Only a very simple procedure was needed to prepare specific single-guide RNA expression vectors with high target accuracy. Since the de novo zygotic transcription had been detected in mouse embryo at the 1-cell stage, the plasmid DNA vectors encoding Cas9 and GGTA1 gene specific single-guide RNAs were micro-injected into zygotic pronuclei to confirm such phenomenon in 1-cell pig embryo. Our results demonstrated that mutations caused by these CRISPR/Cas9 plasmids occurred before and at the 2-cell stage of pig embryos, indicating that besides the cytoplasmic microinjection of in vitro transcribed RNA, the pronuclear microinjection of CRISPR/Cas9 DNA vectors provided an efficient solution to ...
[摘要] 构建了一套Cas9和单引导CRISPR RNA表达载体。 需要一个非常简单的程序来制备具有高目标精度的特异性单向RNA表达载体。 由于在1细胞期的小鼠胚胎中已经检测到了合并的合子转录，所以将编码Cas9和GGTA1基因特异性单向RNA的质粒DNA载体微注射到合子原核中以确认 1细胞猪胚胎现象。 我们的研究结果表明，这些CRISPR / Cas9质粒引起的突变发生在猪胚胎的2细胞阶段之前和之后，表明除了体外转录的RNA的细胞质显微注射外，CRISPR / Cas9 DNA载体为产生基因敲除猪提供了有效的解决方案。
背景 由于最初发现了大肠杆菌基因组（Ishino）中的大肠杆菌基因组下游的32bp间隔的串联重复的高度保守的29个碱基对（bp）序列，等等，1987; Nakata等人，1989），在约50％至50bp的大小变化的短定期间隔重复序列的家族中发现约50％细菌和90％的古细菌（Makarova等人，2015）。根据它们的特征结构，Mojica（Mojica等人，2009）和Jansen（Jansen等人）引入了定期交织的短回文重复序列（CRISPR）的名称， ，2002），目前普遍使用。首先通过核苷酸序列比对（Jansen等人，2002）在CRISPR基因座的侧翼首先鉴定了一组CRISPR相关基因 cas1 ...
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