| FRET-based Microscopy Assay to Measure Activity of Membrane Amino Acid Transporters with Single-transporter Resolution
|
|
Author:
Date:
2021-04-05
[Abstract] Secondary active transporters reside in cell membranes transporting polar solutes like amino acids against steep concentration gradients, using electrochemical gradients of ions as energy sources. Commonly, ensemble-based measurements of radiolabeled substrate uptakes or transport currents inform on kinetic parameters of transporters. Here we describe a fluorescence-based functional assay for glutamate and aspartate transporters that provides single-transporter, single-transport cycle resolution using an archaeal elevator-type sodium and aspartate symporter GltPh as a model system. We prepare proteo-liposomes containing reconstituted purified GltPh transporters and an encapsulated periplasmic glutamate/aspartate-binding protein, PEB1a, labeled with donor and acceptor fluorophores. We then ...
[摘要] [摘要]次级活性转运蛋白驻留在细胞膜中，利用离子的电化学梯度作为能量源，可针对陡峭的浓度梯度转运极性氨基酸（如氨基酸）。通常，基于集合的放射性标记底物摄取或转运电流的测量可确定转运蛋白的动力学参数。在这里，我们描述了一种基于荧光的谷氨酸和天冬氨酸转运蛋白功能测定方法，该方法使用古细菌升降剂型钠和天冬氨酸共转运蛋白Glt Ph作为模型系统，提供了单转运蛋白，单转运周期的分辨率。我们准备包含重组的纯化的Glt Ph转运蛋白和封装的周质谷氨酸/天冬氨酸结合蛋白，PEB1a，用供体和受体荧光团标记的蛋白脂质体。然后，我们将蛋白脂质体表面固定化，并使用单分子全内反射荧光（TIRF）显微镜测量随时间变化的运输依赖性荧光共振能量转移（FRET）效率变化。与放射性配体摄取测定法相比，该测定法在时间分辨率上提高了10-100倍。它还可以对不同转运周期步骤进行动力学表征，并识别转运蛋白种群内的动力学异质性。
[背景]膜驻留的二级主动转运蛋白或溶质载体（SLC）介导氨基酸，激素，神经递质，维生素和药物等溶质的细胞摄取。他们将集中的底物摄取与主要通过Na + / K + ATPases的作用维持的离子电化学梯度的能量上有利的耗散结合在一起（Lingrel and Kuntzweiler ...
|
|
|
| Ubiquitin Proteasome Activity Measurement in Total Plant Extracts
|
|
Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] The fine-tuned balance of protein level, conformation and location within the cell is vital for the dynamic changes required for a cell to respond to a given stimulus. This requires the regulated turnover of damaged or short-lived proteins through the ubiquitin proteasome system (UPS). Thus, the protease activity of the proteasome is adjusted to meet the current demands of protein degradation via the UPS within the cell. We describe the adaptation of an intramolecular quenched fluorescence assay utilizing substrate-mimic peptides for the measurement of proteasome activity in total plant extracts. The peptide substrates contain donor-quencher pairs that flank the scissile bond. Following cleavage, the increase in dequenched donor emission of the product is subsequently measured over time ...
[摘要] 细胞内的蛋白质水平，构象和位置的微调平衡对于细胞对给定刺激作出反应所需的动态变化是至关重要的。 这需要通过泛素蛋白酶体系统（UPS）调节受损或短寿命蛋白质的周转。 因此，调节蛋白酶体的蛋白酶活性以满足目前通过细胞内的UPS的蛋白质降解的需求。 我们描述了使用底物 - 模拟肽进行分子内淬灭荧光测定来测定总植物提取物中蛋白酶体活性的适应性。 肽底物含有侧向于剪切键的供体 - 猝灭剂对。 切割后，随后随时测量产物的去质子供体发射的增加，并用于计算相对蛋白酶体活性。
【背景】泛素蛋白酶体系统（UPS）是真核细胞中主要的蛋白质降解机制，因此，UPS对许多细胞过程的调节至关重要，包括信号传导，细胞周期，囊泡运输和免疫。用于营业额的蛋白质通过泛素的共价连接标记，然后被26S蛋白酶体降解。 26S蛋白酶体由两个亚颗粒组成，即20S核心蛋白酶（CP），其分隔蛋白酶活性位点和19S调节颗粒，其将适当的底物识别并转移到CP腔中进行分解。调节蛋白酶体活性以维持蛋白酶抑制以响应内部和外部条件的波动。我们最近显示，UPS涉及植物免疫的几个方面，一系列植物和动物病原体颠覆了UPS来增强其毒力（Üstünet al。，2013;üstünet al。，2014;ÜstünandBörnke，2015 ;Üstünet ...
|
|
|
| Measurement of Cellular Copper in Rhodobacter capsulatus by Atomic Absorption Spectroscopy
|
|
Author:
Date:
2016-10-05
[Abstract] Copper is an essential micronutrient and functions as a cofactor in many enzymes such as heme-Cu oxygen reductases, Cu-Zn superoxide dismutases, multi-copper oxidases and tyrosinases. However, due to its chemical reactivity, free copper is highly toxic (Rae et al., 1999) and all organisms use sophisticated machineries for controlling uptake, storage and export of Cu. The strict control of the cellular Cu homeostasis prevents toxic effects but sustains synthesis of cuproproteins. Monitoring the copper levels within the cell and within different cellular compartments is an essential approach for identifying the contribution of different proteins in maintaining the cellular copper equilibrium. Therefore, whole cells and whole-cell lysates, which can be further fractionated into ...
[摘要] 铜是必需的微量营养素并且在许多酶如辅酶Cu氧还原酶，Cu-Zn超氧化物歧化酶，多铜氧化酶和酪氨酸酶中起辅因子的作用。然而，由于其化学反应性，游离铜是高毒性的（Rae等人，1999），并且所有生物体使用复杂的机器来控制Cu的摄取，储存和输出。严格控制细胞铜稳态防止毒性作用，但维持铜蛋白的合成。监测细胞内和不同细胞区室内的铜水平是识别不同蛋白质在维持细胞铜平衡中的贡献的必要方法。因此，可以进一步分离成细胞质和周质的全细胞和全细胞裂解物被消化，并通过Lowry测定法测定蛋白质浓度。随后，通过原子吸收光谱（AAS）测量铜含量，并计算每mg蛋白质的Cu含量。这提供了产生关于细胞Cu含量的可定量结果的简单且成本有效的方法。为了举例说明这种方法，我们使用光养型α-变形杆菌荚膜红细菌（Rhodobacter capsulatus），其通常用作研究细菌细胞中Cu运输的模式生物体（Ekici等人）。 ，2012）。
[背景] 由于对细胞Cu稳态的兴趣日益增长，在过去几年中开发了用于测量细胞Cu含量的不同方法。它们包括电化学和荧光方案，电感耦合等离子体质谱（ICP-MS），电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP-AES），电子微探针分析（EMPA），X射线吸收光谱（XAS）或同步辐射X ...
|
|
|