| Ligand and Carbohydrate Engagement (LACE) Assay and Fluorescence Quantification on Murine Neural Tissue
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Author:
Date:
2021-03-20
[Abstract] The interaction between cell surface heparan sulphate and diffusible ligands such as FGFs is of vital importance for downstream signaling, however, there are few techniques that can be used to investigate this binding event. The ligand and carbohydrate engagement (LACE) assay is a powerful tool which can be used to probe the molecular interaction between heparan sulphate and diffusible ligands and can detect changes in binding that may occur following genetic or pharmacological intervention. In this protocol we describe an FGF17:FGFR1 LACE assay performed on embryonic mouse brain tissue. We also describe the method we have used to quantify changes in fluorescent LACE signal in response to altered HS sulphation.
[摘要] [摘要]细胞表面硫酸乙酰肝素与可扩散配体（例如FGFs）之间的相互作用对于下游信号传导至关重要，但是，很少有技术可用于研究这种结合事件。配体和碳水化合物结合（LACE）分析是一种功能强大的工具，可用于探测硫酸乙酰肝素与可扩散配体之间的分子相互作用，并可检测在遗传或药理学干预后可能发生的结合变化。在此协议中，我们描述了在胚胎小鼠脑组织上进行的FGF17：FGFR1 LACE分析。我们还描述了我们用来量化荧光LACE信号响应HS硫酸盐改变的变化的方法。
[背景]硫酸乙酰肝素（HS）是一种细胞外基质和细胞表面糖胺聚糖分子，可通过硫酸化进行广泛修饰。HS与包括FGF，Wnt，BMP和Slits在内的多种具有重要发展意义的信号分子相互作用。例如，在FGF信号传导期间，HS充当共受体，促进FGF配体与细胞表面FGFR受体的结合。此形成HS：FGF：FGFR需要复杂的对FGF信号发生（阿伦等人，2001） 。已显示HS的差异硫酸化会影响FGF配体与其FGFR细胞表面受体的结合。在我们最近的论文中，我们使用了配体和碳水化合物结合（LACE）分析方法来检测HS和FGF蛋白之间的相互作用（Clegg et ...
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| Organotypic Slice Culture of the Embryonic Mouse Brain
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Author:
Date:
2020-07-05
[Abstract] Organotypic slice culture is a powerful technique for exploring the embryonic development of the mammalian brain. In this protocol we describe a basic slice culture technique we have used for two sets of experiments: axon guidance transplant assays and bead culture assays.
[摘要] [摘要]器官型切片培养是探索哺乳动物大脑胚胎发育的有力技术。在这个方案中，我们描述了一种基本的切片培养技术，我们已经用于两组实验：轴突引导移植实验和珠子培养实验。
[背景] 器官型切片培养是近年来广泛应用的一种技术，在神经发育领域已成为一种特别流行的技术。它的最大优点是可以在体外培养发育中的神经细胞，同时保持组织的体内结构。在该方案中，我们描述了我们在最近的论文（Clegg等人，2019）中用于两个实验的切片培养技术。首先，我们进行了轴突引导移植实验，将荧光标记的组织移植到非荧光宿主切片上，观察轴突的生长情况。这是先前用于研究胼胝体发育的一个改进版本，但可以很容易地用于检查其他轴突束，如丘脑皮质束（Niquille et al.，2009）。其次，我们进行了微珠培养实验，将浸有重组FGF蛋白的小球植入组织中，检测组织对FGF蛋白的分子和细胞反应。以这种方式使用浸过蛋白的小球提供了一种在特定位置聚焦输送重组蛋白的方法，与将所有组织均匀暴露于蛋白质的浴敷法不同。这模拟了体内的情况，即形态发生素（如FGF17）在特定的解剖位置表达，然后在组织中扩散。该技术可用于探索对多种不同重组蛋白或药物的反应。
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| Hair Follicle Stem Cell Isolation and Expansion
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Author:
Date:
2018-05-20
[Abstract] Stem cells are widely used for numerous clinical applications including limbal stem cell deficiency. Stem cell derived from the bulge region of the hair follicle have the ability to differentiate into a variety of cell types including interfollicular epidermis, hair follicle structures, sebaceous glands and corneal epithelial cells when provided the appropriate cues. Hair follicle stem cells are being studied as a valuable source of autologous stem cells to treat disease. The protocol described below details the isolation and expansion of these cells for eventual clinical application. We used a dual-reporter mouse model to visualize both isolation and eventual differentiation of these cells in a limbal stem cell-deficient mouse model.
[摘要] 干细胞被广泛用于许多临床应用，包括角膜缘干细胞缺陷。 当提供适当的提示时，源自毛囊凸出区域的干细胞具有分化成多种细胞类型的能力，包括滤泡间表皮，毛囊结构，皮脂腺和角膜上皮细胞。 正在研究毛囊干细胞作为自体干细胞治疗疾病的宝贵来源。 下面描述的方案详细描述了这些细胞的最终临床应用的分离和扩增。 我们使用双报告小鼠模型来观察这些细胞在角膜缘干细胞缺陷小鼠模型中的分离和最终分化。
【背景】干细胞被广泛用于多种翻译和临床应用。一种这样的临床应用是用于治疗角膜缘干细胞缺陷（LSCD）。当角膜缘干细胞群存在功能障碍或丧失时，LSCD发生，这对于由于先天性或获得性病理而维持健康的眼表非常重要。 LSCD的主要治疗策略是从患者健康眼睛的角膜缘活检组织培养自体上皮细胞片（Pellegrini等人，1997; Shortt等人，2007） 。这种策略的局限性在于它只适用于患有单侧LSCD的患者。那些有双侧LSCD的患者必须依靠免疫相关活体供体或尸体组织的同种异体角膜缘活检。由于全身性免疫抑制治疗的需要和供体组织的有限可用性，治疗成功率降低。一些研究小组一直在研究使用培养的口腔粘膜细胞治疗LSCD并取得了一些成功。然而，这些细胞通常不能表达角膜上皮分化标记角蛋白12（Inatomi等，2006），并且经常导致外周血管新生的发展（Nakamura等人， ，2004; ...
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