| Polyamine and Paraquat Transport Assays in Arabidopsis Seedling and Callus
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] Polyamines (PAs) are polycationic compounds found in all living organisms and play crucial roles in growth and survival. We here show the ‘Polyamine and paraquat (PQ) transport assay’ protocol, which can be used to examine the uptake activity of PA/PQ transporters. We have used this protocol to demonstrate that PUT3 in Arabidopsis is a polyamine transporter and is able to take up spermidine and its analog paraquat.
[摘要] 多胺（PA）是在所有生物体中发现的聚阳离子化合物，在生长和生存中起关键作用。 我们在这里展示了“多胺和百草枯（PQ）运输测定”方案，可用于检查PA / PQ转运蛋白的摄取活性。 我们已经使用该协议来证明拟南芥中的PUT3是多胺转运蛋白，并且能够吸收亚精胺及其类似百草枯。
【背景】PA通过与阴离子大分子如DNA，RNA和蛋白质的功能相互作用和调节而参与基因调控。 在活细胞中，必须调节PA的含量以维持细胞止血。 在高等植物中，三种主要的多胺，腐胺（Put），亚精胺（Spd）和精胺（Spm）以游离形式或缀合形式与其他分子一起存在（Gill和Tuteja，2010）。 在酵母中，鉴定了四种质膜多胺转运体DUR3，SAM3，GAP1和AGP2（Uemura等人，2007）。 在拟南芥中，鉴定了5种推定的多胺摄取转运蛋白（PUT1-PUT5），并且PUT1-3已被实验验证为多胺转运蛋白（Mulangi等人，2012; Li et al，2013）。 我们以下所述的方案成功证实了PUT3是多胺和百草枯的流入转运蛋白，并且在Put3突变体（Shen等人，2016）中PQ /Spd吸收受损）。
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| Fat Turnover Assay in Drosophila
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Author:
Date:
2016-11-05
[Abstract] Like all animals, Drosophila shows robust fat (triglyceride) turnover, i.e., they synthesize, store and utilize triglyceride for their daily metabolic needs. The protocol describes a simple assay to measure this turnover of triglycerides in Drosophila.
[摘要] 像所有动物一样，果蝇表现出强劲的脂肪（甘油三酯）周转，即，它们合成，储存和利用甘油三酯用于其日常代谢需要。 该方案描述了测量果蝇中甘油三酯转化的简单测定法。 几乎所有的动物都以 糖原和甘油三酯。 许多生理，病理和环境条件引起这些能量储备的总水平的变化，特别是甘油三酯。 然而，并不总是清楚甘油三酯中所导致的变化是由于减少的分解，增加的合成，或反之亦然。 使用此协议，可以确定新合成的甘油三酯在苍蝇中的合成速率和降解。
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| A Filter Binding Assay to Quantify the Association of Cyclic di-GMP to Proteins
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Author:
Date:
2015-02-05
[Abstract] Cyclic di-GMP (c-di-GMP) is a ubiquitous second messenger that regulates many processes in bacteria including biofilm formation, motility, and virulence (Hengge, 2009). Analysis of c-di-GMP binding properties of bacterial proteins is an important step to characterize c-di-GMP signaling pathways. C-di-GMP binds numerous proteins such as transcription factors, enzymes, and multimeric protein complexes (Hickman and Harwood, 2008, Ryjenkov et al., 2006, Weinhouse et al., 1997). The c-di-GMP binding assay described here is a relatively simple and cost effective method to characterize c-di-GMP binding to a protein using [32P]-labeled c-di-GMP. Radiolabeled c-di-GMP is readily synthesized with a purified GGDEF enzyme [such as WspR from Pseudomonas aeruginosa ...
[摘要] 循环di-GMP（c-di-GMP）是一种普遍存在的第二信使，其调节细菌中的许多过程，包括生物膜形成，运动性和毒力（Hengge，2009）。细菌蛋白的c-di-GMP结合性质的分析是表征c-di-GMP信号传导途径的重要步骤。 C-di-GMP结合许多蛋白质，例如转录因子，酶和多聚体蛋白复合物（Hickman和Harwood，2008，Ryjenkov等人，2006，Weinhouse等人>，1997）。本文所述的c-di-GMP结合测定法是使用[32 P] - 标记的c-di-GMP表征c-di-GMP与蛋白质结合的相对简单且成本有效的方法。放射性标记的c-di-GMP易于用纯化的GGDEF酶[例如来自绿脓假单胞菌（铜绿假单胞菌）（绿脓杆菌）]的WspR和[<32> > P] -GTP（Srivastava等人，2013）。在标记的c-di-GMP与溶液中目标蛋白温育后，将所得混合物通过硝酸纤维素蛋白结合膜过滤。保留在膜上的标记的c-di-GMP的量指示信号和蛋白质之间的相互作用。可以通过与未标记的c-di-GMP或其他核苷酸（例如反应中的GTP）竞争来测试c-di-GMP结合的特异性。通过检测固定蛋白浓度与增加浓度的c-di-GMP的结合，该方法能够确定c-di-GMP-蛋白相互作用的解离常数。
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