| Implementation of Blue Light Switchable Bacterial Adhesion for Design of Biofilms
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Author:
Date:
2018-06-20
[Abstract] Control of bacterial adhesions to a substrate with high precision in space and time is important to form a well-defined biofilm. Here, we present a method to engineer bacteria such that they adhere specifically to substrates under blue light through the photoswitchable proteins nMag and pMag. This provides exquisite spatiotemporal remote control over these interactions. The engineered bacteria express pMag protein on the surface so that they can adhere to substrates with nMag protein immobilization under blue light, and reversibly detach in the dark. This process can be repeatedly turned on and off. In addition, the bacterial adhesion property can be adjusted by expressing different pMag proteins on the bacterial surface and altering light intensity. This protocol provides light ...
[摘要] 在空间和时间上高精度地控制细菌粘附到基底对于形成明确的生物膜是重要的。 在这里，我们提出了一种方法来设计细菌，使其在蓝光下通过光可切换蛋白质nMag和pMag特异性地粘附在基底上。 这为这些交互提供了精妙的时空遥控。 工程菌在表面上表达pMag蛋白，以便它们可以在蓝光下与nMag蛋白固定化的基质粘附，并在黑暗中可逆地分离。 该过程可以重复开启和关闭。 此外，通过在细菌表面表达不同的pMag蛋白质并改变光强度可以调节细菌粘附性质。 该协议提供了可高度空间和时间分辨率的细菌粘附的光可切换，可逆和可调控制，这使我们能够以极大的灵活性在基底上图案化细菌。
【背景】控制生物膜形成对于了解细菌在自然发生的生物膜中的社会相互作用至关重要（Flemming et。，2016）。这对生物膜在生物催化，生物传感和废物处理中的生物技术应用也特别重要（Zhou等人，2013; Jensen等人，2016）。生物膜的形成始终始于细菌与底物的粘附，这决定了生物膜中的空间组织（Liu等人，2016; Nadell等人，2016）。已经提出了许多策略来控制细菌粘附，例如通过脂质体融合利用生物正交反应基团修饰细菌表面（Elahipanah等，2016），将粘附分子固定在基质上（Sankaran等，等），2015; Zhang等人，2016; ...
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| Heterologous Expression and Purification of the CRISPR-Cas12a/Cpf1 Protein
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Author:
Date:
2018-05-05
[Abstract] This protocol provides step by step instructions (Figure 1) for heterologous expression of Francisella novicida Cas12a (previously known as Cpf1) in Escherichia coli. It additionally includes a protocol for high-purity purification and briefly describes how activity assays can be performed. These protocols can also be used for purification of other Cas12a homologs and the purified proteins can be used for subsequent genome editing experiments.
Figure 1. Timeline of activities for the heterologous expression and purification of Francisella novicida Cas12a (FnCas12a) from Escherichia coli
[摘要] 该协议提供了分步说明（图1），用于在大肠杆菌中异源表达新西兰弗朗西斯菌弗朗西丝菌Cas12a（以前称为Cpf1）。 它还包括一个高纯度纯化方案，并简要介绍如何进行活性测定。 这些方案也可以用于其他Cas12a同系物的纯化，并且纯化的蛋白质可以用于随后的基因组编辑实验。
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图1.从大肠杆菌 异源表达和纯化<弗朗西斯弗朗西丝菌 Cas12a（FnCas12a）的活动时间表
【背景】原核CRISPR-Cas免疫系统通过使用CRISPR RNA（crRNA）作为外源DNA或RNA的序列特异性靶向的指导来提供针对病毒和质粒的保护（van der Oost等人，2014; Marraffini ，2015）。 1类CRISPR-Cas系统（包含I型，III型和IV型）通常形成多亚基蛋白-cRNA效应复合物，而2类系统（包含II型，V型和VI型）依赖于单个crRNA-引导的效应物核酸酶用于目标干扰（Mohanraju et al。 2016年）。
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| Guanine Nucleotide Exchange Assay Using Fluorescent MANT-GDP
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] GTPases are molecular switches that cycle between the inactive GDP-bound state and the active GTP-bound state. GTPases exchange nucleotides either by its intrinsic nucleotide exchange or by interaction with guanine nucleotide exchange factors (GEFs). Monitoring the nucleotide exchange in vitro, together with reconstitution of direct interactions with regulatory proteins, provides key insights into how a GTPase is activated. In this protocol, we describe core methods to monitor nucleotide exchange using fluorescent N-Methylanthraniloyl (MANT)-guanine nucleotide.
[摘要] GTP酶是分子开关，在无效GDP结合状态和活性GTP结合状态之间循环。 GTP酶通过其内在的核苷酸交换或通过与鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）的相互作用来交换核苷酸。 监测体外核苷酸交换，以及与调节蛋白直接相互作用的重构，为GTP酶如何被激活提供了重要见解。 在该协议中，我们描述了使用荧光N-甲基呋喃酰基（MANT） - 鸟嘌呤核苷酸来监测核苷酸交换的核心方法。
【背景】GTPase是鸟嘌呤核苷酸结合蛋白，调节细胞过程的广度，从蛋白质生物合成到细胞周期进展，从细胞骨架重组到膜运输。 GTPases可以被认为是分子开关，它在GDP结合“关闭”状态和GTP结合“开启”状态之间循环;在通过GTP的GDP核苷酸交换结合GTP时，GTP酶变得活跃并且将结合下游效应蛋白以招募和激活这些效应子的生物学功能。 GTP酶通过与开关I环（G2结构域）的高度保守苏氨酸和开关II环（G3结构域）的DxxG基序内的甘氨酸的相互作用结合GTP的γ-磷酸。 GTP水解后，与γ-磷酸相互作用的丧失导致动态构象变化，从而使GTPase变为关闭状态（Vetter and ...
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