| Measurement of Ascorbic Acid and Glutathione Content in Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803
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Author:
Date:
2020-10-20
[Abstract] Ascorbic acid (AsA) and gluthathione (GSH) are two key components of the antioxidant machinery of eukaryotic and prokaryotic cells. The cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 presents both compounds in different concentrations (AsA, 20-100 μM and GSH, 2-5 mM). Therefore, it is important to have precise and sensitive methods to determine the redox status in the cell and to detect variations in this antioxidants. In this protocol, we describe an improved method to estimate the content of both antioxidants (in their reduced and oxidized forms) from the same sample obtained from liquid cultures of Synechocystis sp. PCC 6803.
[摘要] [摘要] 抗坏血酸（AsA）和明胶硫（GSH）是真核细胞和原核细胞抗氧化机制的两个重要组成部分。蓝藻Synechocystis sp.pcc6803以不同浓度（AsA，20-100μM和GSH，2-5mm）呈现这两种化合物。因此，有精确和敏感的方法来确定细胞中的氧化还原状态和检测这种抗氧化剂的变化是很重要的。在该方案中，我们描述了一种改进的方法，用以从Synechocystis sp.pcc6803的液体培养中获得的同一样品中估算两种抗氧化剂（以还原形式和氧化形式）的含量。
[背景] 细胞中的氧化还原状态可以被多种因素改变，产生氧化应激。我们使用该方案来量化暴露于50℃高温下的Synechocystis sp. PCC 6803中的GSH和AsA含量。如拟南芥所述，热胁迫导致抗氧化剂含量下降，并通过铁作用引起细胞死亡(Distefano et al.， 2017;Aguilera等人，2019年预印本)。虽然本方案是针对Synechocystis sp. PCC 6803制定的，但也可用于测定其他蓝藻中GSH和AsA的含量。蓝藻中AsA含量很低，正常条件下uM含量在一定范围内，某些处理下pM含量在一定范围内。因此，我们提出了这个敏感的方法与一个改进的细胞裂解程序。
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| In vitro mTORC1 Kinase Assay for Mammalian Cells Protocol
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Author:
Date:
2016-06-05
[Abstract] Historically, mechanistic target of rapamycin (mTOR) was purified from mammalian cells using mild nonionic detergents such as NP-40 and or Triton-X100 that resulted in dissociation of core regulatory components essential for its native kinase activity. Consequently, these older kinase assays required MnCl2 to artificially enhance the weak phosphotransfer activity observed (Bai et al., 2007; Kim et al., 2002). With the use of the zwitterionic detergent 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS), the mTOR complex 1 (mTORC1) containing Regulatory-associated protein of mTOR (Raptor) and Lst8 (also known as GbetaL) can be successfully purified as a complex. This in vitro kinase assay allows for purification of mTORC1 that resembles ...
[摘要] 历史上，使用温和的非离子去污剂如NP-40和或Triton-X100从哺乳动物细胞纯化雷帕霉素（mTOR）的机械目标，导致其天然激酶活性所必需的核心调节组分的解离。因此，这些较老的激酶测定需要MnCl 2以人工增强观察到的弱磷酸转移活性（Bai等人，2007; Kim等人）。 ，2002）。使用两性离子去污剂3 - [（3-胆碱酰氨基丙基）二甲基铵基] -1-丙磺酸盐（CHAPS），含有mTOR（Raptor）和Lst8（也称为GbetaL）的调节相关蛋白的mTOR复合物1（mTORC1）可以成功地纯化为复合物。这种体外激酶测定允许纯化类似于其生理状态并在生理性MgCl 2浓度下保持激酶活性的mTORC1（Sancak等人）。 ，2007）。 mTORC1的活性可以通过使用mTOR的激酶结构域内的过度活跃突变或包含补充到体外激酶测定中的富含脑部（Rheb）的GTP结合的RAS来进一步增强。 Rheb是结合并激活mTORC1以磷酸化下游底物的小G蛋白，例如真核起始因子4E-BP1（4E-BP1）（Burnett等人，1998），核糖体蛋白S6激酶1（S6K1）（Kim等人，2002），信号转导物和转录激活因子3（STAT3）（Dodd等人，2015）和脯氨酸富集的40kDa的Akt底物（PRAS40）（Dunlop等人，2009）。
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